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市场上的基于碱变性法的质粒提取试剂盒都是为提取大肠杆菌质粒DNA的提取而开发的，本试剂盒是以碱变性法为基础、专门为农杆菌质粒DNA提取而开发的。其过程是首先菌体经离心悬浮后，被SDS和碱裂解，并且碱使基因组DNA和质粒DNA变性，随后用酸中和，质粒DNA可以快速复性，而基因组DNA不能快速复性，故可以通过离心去除。

• 专门为农杆菌质粒提取优化，不适用于非农杆菌。
  
• 适用于常见的穿梭质粒和双元质粒，不适用于pTi或pRi等大型质粒，提取这些质粒DNA需另购本公司专门的相关产品。
  
• 快速、步骤少，整个操作在40分钟左右完成。
  
• 溶液B中有蓝色染料，便于目测非常关键的碱变性和中和反应两步的溶液混匀状况，保证实验效果。
  
• 产量高，每毫升过夜培养的菌液可以提取到2～5μg/mL（取决于质粒是高拷贝、中拷贝还是低拷贝）。
  
• 本制品足够50次微量提取，一次可以处理4～5mL过夜培养的菌液。
  
• 纯度高，采用本试剂盒提取的质粒A260/A280在1.8～2.0之间，可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。
  
• 本制品只能用于科研。

• 实验前将农杆菌质粒DNA纯化溶液A（下面简称溶液A）和农杆菌质粒DNA纯化溶液C（下面简称溶液C）放冰上预冷。第一次使用时把本试剂盒提供的细菌裂解增效剂全部加入到溶液A中，轻柔混匀后待用。
  
• 从筛选平板上挑取农杆菌单菌落至含抗生素的培养基中，28℃震荡培养12～16小时（摇床转速200～300rpm），使其OD600达到1.0-1.2（刚进入平台期）。
  
  • 建议使用YEP培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统的处理能力而降低质粒DNA的质量。另外，延长培养时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。
• 用1.5mL离心管收集1.5mL过夜培养饱和菌液，4℃ 14000rpm离心1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
  
• 再加入1.5mL过夜培养饱和菌液，4℃ 14000rpm离心1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
  
• 可以重复上步操作，直到累计得到4～5mL菌液沉淀。
  
• 用1mL自备的蒸馏水重悬细菌沉淀，14000rpm离心1分钟后弃上清。
  
• 在沉淀中加入150μL冰上预冷的溶液A，用枪头充分吹打或漩涡振荡使菌体充分重悬。
  
  • 如果细胞未充分悬浮将会严重影响后续碱变性，降低质粒DNA回收率。
• 室温放置5分钟。
  
• 加入300μL农杆菌质粒DNA纯化溶液B（下面简称溶液B），溶液将变得粘稠。
  
  • 如果溶液B在低温放置产生沉淀，须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用。
    
  • 溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的碱，降低其效率。
    
  • 如果溶液B颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不用并且跟厂家联系。
• 温和颠倒混匀5～6次（根据蓝色的均匀程度判断）后在冰上准确放置10分钟。
  
  • 此步不要剧烈振荡，冰上放置时间也不要超过10分钟。
• 加入250μL冰上预冷的溶液C，温和反复颠倒4～6次，溶液将变成无色，并有白色絮状沉淀产生。
  
• 冰上放置至少10分钟让质粒DNA复性。不能短于10分钟。
  
• 4℃ 14000rpm离心10分钟，小心将上清液（只取600μL）转移到一个新离心管中。
  
  • 此时的溶液比重较大，部分絮状物悬浮在上清液中属正常现象，吸取上清时避开这些悬浮物即可。
• 加入10μL本试剂盒提供的RNase A溶液（10mg/mL），室温放置20分钟。
  
• 加入600μL质粒去蛋白溶液，涡旋震荡器上充分震荡2分钟。
  
• 4℃ 14000rpm离心2分钟，将水相（无色部分）转移到一个新的离心管中，不要取有颜色的相。
  
• 加等体积的核酸沉淀剂B型，颠倒30秒混匀后4℃ 14000rpm离心15分钟，质粒DNA将形成沉淀，弃上清。
  
• 加入1mL的自备75%乙醇，室温14000rpm离心1分钟，弃上清。
  
• 室温14000rpm离心半分钟，用移液枪小心取出残留液体（约50μL）。
  
• 室温短暂放置半分钟。
  
• 加入50～100μL DNA洗脱液重悬沉淀，即得质粒DNA溶液。可以直接用于后续实验。